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________LABORATORIO________
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ESAME
RICERCA CRYPTOSPORIDIUM
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COLORAZIONE ZIEHL-NEELSEN MODIFICATA
Nella diagnosi di routine, nel fare una diagnosi definitiva, molte difficoltà sono dovute principalmente a problemi di riconoscimento dell'organismo, nel differenziarlo dai lieviti e da altri piccoli elementi nelle feci.
La tecnica Ziehl-Neelsen modificata per la colorazione di strisci fecali, dà ottimi risultati per il riconoscimento delle oocisti di Cryptosporidium sp.
Quando le oocisti dei coccidi sono colorate con la soluzione di carbofucsina, resistono alla decolorazione con una soluzione di acido o etanolo-acido, rimanendo colorate in rosso. Gli altri elementi e organismi sono decolorati dalla soluzione etanolo-acido e vengono visualizzati con un controcolorante come il blu di metilene.
Questa procedura è ugualente utile per il riconoscimento delle oocisti di Cystoisospora belli e di Cyclospora sp nelle feci.
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| Reagenti
| | Carbofucsina (colorante per Ziehl-Neelsen)
| | Etanolo-acido: 3 ml di acido cloridrico concentrato + 97 ml di etanolo 95%
| | Blu di metilene: 0.3 gr di blu di metilene + 100 ml di acqua distillata |
| | | Indossare i guanti. | | | | | | | | Omogenare il campione con una spatola.
| | | | | | | | Filtrare il campione utilizzando un imbuto di plastica contenente una doppia garza 10x10 cm inumidita con acqua. | | | | | | | | Filtrare. | | | | | | | | Aiutandosi con una pinza, senza strizzare la garza, far scendere il filtrato. | | | | | | | | Centrifugare per 10 minuti a 2000 rpm (500 g). | | | | | | | | Eliminare il surnatante. | | | | | | | | Vortexare il campione, attendere alcuni secondi che i residui grossolani siano sedimentati.
| | | | | | | | Aspirare con una pipetta Pasteur il materiale non sedimentato. | | | | | | | | Depositare circa 50 µl (una goccia) di campione su un vetrino portaoggetto. | | | | | | | | Lasciare asciugare il vetrino in termostato a 37°C almeno un’ora prima di procedere con la colorazione. |
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| | | Colorazione | | | | Fissare in alcool metilico per 5 minuti.
| | | | | | | | Scolare. | | | | | | | | Lasciar asciugare. | | | | | | | | Coprire il preparato con Fucsina fenicata per 5 minuti. | | | | | | | | Scolare. | | | | | | | | Sciacquare con acqua di fonte. | | | | | | | | Decolorare con una soluzione alcool-acido per circa 20 secondi. | | | | | | | | Scolare. | | | | | | | | Sciacquare con acqua di fonte. | | | | | | | | Coprire il preparato con Blu di metilene per 1 minuto. | | | | | | | | Scolare. | | | | | | | | Sciacquare con acqua di fonte. | | | | | | | | Lasciare asciugare e procedere con l’osservazione microscopica. |
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| | | Lettura microscopica
| | | | Depositare due gocce di olio ad immersione sui vetrini colorati. | | | | | | | | Coprire con un vetrino coprioggetto. | | | | | |  | | Esaminare in modo regolare il preparato, partendo da un lato fino ad arrivare a quello opposto con obiettivo 40x. | | | | | | | | In presenza di forme compatibili con oocisti di Cryptosporidium spp aggiungere sopra il coprioggetto una goccia di olio ad immersione. | | | | | | | | Osservare con obbiettivo 100x. |
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| | Bibliografia
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| Parasites: A guide to laboratory procedures and identification; L. R.Ash, T. C.Orihel; ASCP Press, Chicago, 1991.
| | - | Diagnostic Medical Parasitology; 2nd ed.; L. S.Garcia, D. A.Bruckner; American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1993.
| | - | Atlas of Wuman Protozoa-Atlante dei Protozoi Umani; E.G.Rondanelli, M.Scaglia; Masson, 1993. | | - | Parassiti e Parassitosi Umane dalla clinica al laboratorio; M.Scaglia, S.Gatti, E.G. Rondanelli; Selecta Medica, 2006. |
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