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________LABORATORIO________
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ESAME
Ab anti-Strongyloides stercoralis
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METODO IFAT Metodo messo a punto nel nostro laboratorio, con sensibilità e specificità del 97,5% e 98,3% rispettivamente, a titolo 1:20, evinte da uno studio su una popolazione di 122 casi positivi e 229 controlli negativi.
Le immunoglobuline anti Strongyloides stercoralis del siero umano, eventualmente presenti nel campione, si legano alle larve L3 (antigene) presenti nei pozzetti. Con dei lavaggi si eliminano tutti i componenti che non si sono legati.
Le immunoglobuline fissate all'antigene vengono rilevate utilizzando una globulina anti globuline umane marcata con fluorescina.
Tramite ulteriori lavaggi si eliminano tutti i componenti che non si sono fissati.
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'uso. Procedimento
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Preparare il PBS.
Il PBS ricostituito può essere conservato ad un temperatura tra 2-8°C fino a massimo di 30 giorni.
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Preparare le provette per le diluizioni.
Controllo positivo (3 pozzetti): diluizione precedente al titolo, il titolo e la diluizione successiva.
Controllo negativo (1 pozzetto): diluizione 1:20
Siero del paziente: diluizione a fattore 2 (1+1): 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc.
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Distribuire il PBS nelle provette.
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Sieri freschi o congelati a -20 °C o meno.
Evitare di congelare e scongelare più volte.
Non utilizzare sieri emolizzati, lipemici o contaminati.
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Ad ogni passaggio di diluizione mescolare molto bene il campione con un vortex.
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Deporre 25 µl di ogni diluizione del siero all'interno del pozzetto (una diluizione per ogni cerchio).
Assicurarsi che il siero penetri all'interno della membrana e che non debordi dal pozzetto.
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Incubare a 37 °C per 30' in camera umida.
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Riempire la vaschetta di lavaggio con PBS.
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Dopo aver fatto assorbire il liquido dai pozzetti per tamponamento (velocemente), immergere il vetrino capovolto nella vaschetta contenete il PBS. Effettuare 2 lavaggi di 15' e 10' rispettivamente.
Per tutto il tempo del lavaggio agitare a bassissima velocità.
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Preparare il coniugato durante la fase di lavaggio .
Diluire il Blue Evans in PBS, agitare con il vortex.
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Aggiungere alla soluzione di Blue Evans il coniugato.
Mescolare.
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Deporre 25 µl di coniugato all'interno di ogni pozzetto.
Assicurarsi che il coniugato penetri all'interno della membrana.
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Incubare a 37 °C per 30' in camera umida.
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Far assorbire il liquido di ogni pozzetto per tamponamento (velocemente).
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Immergere il vetrino capovolto nella vaschetta contenete il PBS . Effettuare 2 lavaggi di 10' ciascuno.
Per tutto il tempo del lavaggio agitare a bassissima velocità.
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Far assorbire il liquido di ogni pozzetto per tamponamento.
Deporre una piccola goccia di Fluoprep su ogni pozzetto.
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Coprire con un vetrino portaoggetto.
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| | | | | Lettura
 La lettura della reazione si esegue con un microscopio a fluorescenza.
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Bibliografia- M.Gobbo,
A.Carrara, M.Degani, M. Mistretta and Z.Bisoffi. Evaluation of a
serologic test (IF) for the diagnosis of Strongyloides stercoralis
infection. G It Med Trop 1998 (S1): 93-5.- Marina
Boscolo, Maria Gobbo, William Mantovani, Monica Degani,1 Mariella
Anselmi, Geraldo Badona Monteiro, Stefania Marocco, Andrea Angheben,
Manuela Mistretta, Maria Santacatterina, Stefano Tais, and Zeno Bisoffi; Evaluation
of an Indirect Immunofluorescence Assay for Strongyloidiasis as a Tool
for Diagnosis and Follow-Up; Clinical and Vaccine Immunology,
February 2007, p. 129-133, Vol. 14, No. 2.
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