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________LABORATORIO________
Trofozoite di Dientamoeba fragilis. Per saperne di più: Division of Parasitic Diseases (DPDx)-CDC.

ESAME
COLORAZIONE PERMANENTE
PER
PROTOZOI INTESTINALI

Cisti di Giardia intestinalis. Per saperne di più: Division of Parasitic Diseases (DPDx)-CDC.

Una colorazione permanente (tricromica di Gomori mod. Wheathley o Ematossilina ferrica) permette un'ottima differenziazione delle strutture interne dei protozoi intestinali in particolare delle forme trofozoitiche.
 
COLORAZIONE TRICROMICA DI GOMORI mod.
 Reagenti
 Sodio acetato-acido acetico-formalina (SAF)
 Sodio acetato   
Acido acetico glaciale  
Formaldehyde, 37-40%
Acqua distillata  

1.5 gr
2.0 ml
4.0 ml

92.0 ml
 Soluzione fisiologica
 Albumina di Mayer
 Colorante Wheatly Trichrome
 Alcool etilico, soluzioni 70-95-100%
 Xylene
  
 Campione
Feci in SAF
: 3 parti di SAF in 1 parte di feci

  
 Procedimento

 
 Indossare i guanti.
    
 
 

Eliminazione dei residui grossolani

Per ogni campione allestire una provetta da 50 ml identificata con il numero di lavoro giornaliero assegnato.

    
 
 Agitare vigorosamente il campione.
    
 
 Filtrare il campione utilizzando l’imbuto di plastica contenente 2 strati di garza inumiditi con soluzione fisiologica.
    
 
 Aiutandosi con la pinza, senza strizzare la garza, far scendere il filtrato.
    
 
 Portare a 50 ml  con soluzione fisiologica.
    
 
 Avvitare il tappo.
    
    Mescolare per capovolgimento.
    
 
 Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm (500 g).
    
 
 Eliminare il surnatante per inversione della provetta.
Il sedimento finale dovrebbe essere di circa 0,5 a 1,0 ml.
Se necessario, filtrare altro campione o risospendere il campione in soluzione fisiologica e rimuovere parte della sospensione.
    
 
 Lavaggi per eliminare il conservante.

Portare a volume 50 ml con soluzione fisiologica, tappare e mescolare per capovolgimento.
    
    Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm (500 g).
    
    Eliminare il surnatante per inversione della provetta.
    
 
 Aggiungere circa 5 ml di soluzione fisiologica e con la pipetta Pasteur in plastica portare in sospensione il sedimento.
    
 
 Trasferire il sedimento in una provetta conica da 10 ml identificata con lo stesso numero.
    
 
 

Portare a volume 10 ml con soluzione fisiologica.

    
 
 Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm (500 g).
    
    Eliminare tutto il surnatante per inversione della provetta.
    
 
 Preparazione del vetrini.
Contrassegnare il vetrino con il numero giornaliero di lavoro.
    
   Con una pipetta Pasteur in plastica mescolare il sedimento.
    
   Depositare sul vetrino portaoggetto una piccola goccia di campione.
    
   Mettere una pari quantità di albumina di Mayer vicino al campione.
    
   Mescolare con la punta di un bastoncino di legno.
    
 
 Appoggiare il bastoncino di legno sul campione, parallelamente al vetrino e con un movimento a zig-zag distribuirlo fino all’estremità opposta del vetrino.
    
 
 Lasciare asciugare i vetrini in termostato a 37°C per almeno 30 minuti.
Procedere con la colorazione.
   Colorazione
 
 Alcool etilico 70%.
3 minuti.
    
 
 Tamponare su un foglio di carta assorbente.
    
 
 Colorante tricromica.
15 minuti.
    
 
 Tamponare su un foglio di carta assorbente.
    
 
 Alcool etilico 95%.
4 secondi.
    
 
 Alcool etilico 100%.
8 secondi.
    
 
 Alcool etilico 100%.
3 minuti.
    
 
 Alcool etilico 100%.
3 minuti.
    
 
 Xilene.
3 minuti.
    
    Xilene.
5 minuti. 
    
 
 Tamponare su un foglio di carta assorbente.
    
 
 Lasciare asciugare i vetrini sotto cappa aspirante per tutta la notte.
Procedere con la lettura.
   Lettura
 
 Depositare due gocce di olio da immersione sul vetrino colorato.
    
 
 Coprire con un vetrino coprioggetto  24x60 mm.
    
 
 Aggiungere sopra il coprioggetto una goccia di olio da immersione.
    
 
 Con obbiettivo 100x osservare almeno 200 campi. 



Esame Colorazione tricromica
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