|
|
|
|
________LABORATORIO________
|
|
|
|
|
|
|
|
|
RICERCA MALARIA
Emoscopia diretta
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Il ciclo biologico dei parassiti malarici prevede nell’uomo una fase eritrocitaria in cui il parassita è presente nei globuli rossi ed è per questo motivo che i parassiti vanno ricercati su preparati di sangue colorati con colorazione panottica (Giemsa). Vengono allestiti goccia spessa e striscio sottile. La goccia spessa permette di concentrare i parassiti e di valutarne la parassitemia. Lo striscio sottile permette di stabilire la specie e di valutarne la parassitemia in caso di infezioni rilevanti. GOCCIA SPESSA E STRISCIO SOTTILE
www.atlas-malaria.com
|
|
|
Campione
Sangue senza anticoagulante
Ottimale in quanto l'anticoagulante potrebbe provocare modificazioni morfologiche dei parassiti.
Sangue con anticoagulante (K2 EDTA)
Può portare a delle modificazioni morfologiche dei parassiti.
Il Plasmodium vivax può apparire ovalizzato o sfrangiato e i gametociti maschili delle quattro specie possono exflagellare. Procedimento
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Esecuzione dello striscio sottile
|
|
|
|
|
|
|
|
Ottimali per l'esecuzione della goccia spessa e lo striscio sottili sono i vetrini con la banda sabbiata. Prendere un vetrino dai bordi in modo da non lasciare eventuali tracce di talco sulla superficie piana del vetrino.
|
|
|
|
|
|
|
|
Mescolare dolcemente la provetta per inversione per circa 15 secondi.
|
|
|
|
|
|
|
|
Depositare circa 1-2 µl di sangue vicino alla banda sabbiata del vetrino.
|
|
|
|
|
|
|
|
Posizionare un vetrino a bordi molati davanti alla goccia di sangue con un'inclinazione di circa 45°.
|
|
|
|
|
|
|
|
Retrocedere fino a toccare il sangue.
|
|
|
|
|
|
|
|
Con un movimento lineare strisciare il sangue.
|
|
|
|
|
|
|
|
Dimensioni, forma e spessore ideali di uno striscio sottile.
|
|
|
|
|
|
|
Identificare il vetrino.
Per identificare i vetrini non utilizzare inchiostro che si possa dissolvere durante la colorazione.
E' preferibile utilizzare una matita.
|
|
|
|
|
|
|
|
Esecuzione della goccia spessa
|
|
|
|
|
|
|
|
Ottimali per l'esecuzione della goccia spessa e lo striscio sottili sono i vetrini con la banda sabbiata. Prendere un vetrino dai bordi in modo da non lasciare eventuali tracce di talco sulla superficie piana del vetrino.
|
|
|
|
|
|
|
|
Depositare circa 3-4 µl di sangue al centro del vetrino.
|
|
|
|
|
|
|
|
Appoggiare al centro della goccia di sangue un angolo di un altro vetrino e con un movimento rotatorio allargare il sangue.
|
|
|
|
|
|
|
|
A operazione conclusa lo spessore ottimale del sangue dovrebbe essere tale da permettere di vederci attraverso.
|
|
|
|
|
|
|
|
Dimensioni e spessore ottimali di una goccia spessa.
|
|
|
|
|
|
|
Identificare il vetrino.
Per identificare i vetrini non utilizzare inchiostro che si possa dissolvere durante la colorazione.
E' preferibile utilizzare una matita.
|
|
|
|
| | - Colorazione di Giemsa | | | - Colorazione di May-Grunwald Giemsa | | | - Colorazione di Field |
| |
In letteratura si trovano descritte molte "ricette" per la diluizione o i tempi di colorazione.
Nel nostro laboratorio è in uso la colorazione di Giemsa con le diluizioni del colorante e i tempi di colorazione indicati di seguito.
|
| |
Soluzione di Giemsa al 10% in acqua pH 7,2
|
| | - Soluzione madre Giemsa | 10 ml | | | - Acqua tamponata
| 90 ml |
| |
Soluzione di Giemsa al 2,5% in acqua pH 7,2
|
| | - Soluzione Giemsa 10%
| 20 ml | | | - Acqua tamponata
| 80 ml |
|
|
|
|
|
|
|
|
Colorazione striscio sottile
|
|
|
|
|
|
|
|
Preparare una soluzione di Giemsa al 10% in acqua tamponata.
|
|
|
|
|
|
|
|
Fissare il preparato in alcool metilico per 3 minuti.
|
|
|
|
|
|
|
|
Scolare e lasciare asciugare.
|
|
|
|
|
|
|
|
Immergere il vetrino nel colorante per 25 minuti.
|
|
|
|
|
|
|
|
Lavare energicamente per qualche secondo con acqua di fonte.
|
|
|
|
|
|
|
|
Lasciare asciugare all'aria.
|
|
|
|
|
|
|
|
Colorazione goccia spessa
|
|
|
|
|
|
|
|
Portare il colorante dalla diluizione 10% alla diluizione 2,5% con acqua tamponata.
|
|
|
|
|
|
|
|
Immergere il vetrino nel colorante per 15 minuti.
|
|
|
|
|
|
|
|
Lavare delicatamente con un spruzzetta contenente acqua a pH 7,2.
|
|
|
|
|
|
|
|
Lasciare asciugare all'aria.
|
|
|
|
| | | | | Lettura microscopica diretta Sulla goccia spessa mettere una goccia di olio da immersione.Osservare il preparato con obbiettivo ad immersione 100x per almeno 200 campi microscopici.Se la goccia spessa si rivela positiva, esaminare lo striscio sottile per stabilirne la specie di plasmodio.In caso di positività da Plasmodium falciparum si procede al calcolo della stima di parassitemia. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
