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________LABORATORIO________
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ESAME
COPROPARASSITOLOGICO
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RITCHIE MODIFICATO DA BUONOMINI ET AL. (1957)
L'esame coproparassitologico viene eseguito con metodo Ritchie modificato da Buonomini et al. Si tratta di una tecnica di base, valida per tutti i parassiti (elminti e protozoi) che si trovano nelle feci.
Il metodo, tuttavia, è variamente sensibile a seconda del parassita che si ricerca.
Il campione viene raccolto in formalina al 10%, che conserva tutti i parassiti.
I residui grossolani vengono rimossi con la filtrazione, le sostanze solubili in acqua da ripetuti lavaggi.
Gli elementi grassi della sospensione fecale vengono separati mediante estrazione con etere, seguita da centrifugazione.
Al termine della procedura i parassiti saranno concentrati nel sedimento. |
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| | Reagenti
| | | Formalina 10%: 100 ml di Formaldehyde 40% + 900 ml di solution saline 0.85% | | | Solution saline 0.85% (fisiologica)
| | | Etere etilico o acetato di etile | | | | | | Campione
Feci in formalina 10%: 1 parte di feci in 3 parti di formalina 10%
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Eliminazione dei residui grossolani
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Ogni campione deve essere ben omogenato (in caso contrario omogenarlo) e della
consistenza della "cioccolata in tazza"; effettuare un primo esame macroscopico per rilevare l'eventuale presenza di proglottidi di Taenia sp, adulti di Ascaris lumbricoides o quant'altro.
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Allestire
una serie di provette in PVC a fondo conico pari al numero dei
campioni.
Filtrare ciascun campione utilizzando un imbutino di plastica contenente
2 strati di garza inumidita.
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Aiutandosi con delle pinzette, senza strizzare la garza, far scendere il filtrato.
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Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm.
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Eliminare il surnatante per inversione della provetta.
Accertarsi che
per ciascun campione il sedimento rimasto sia di circa 2 ml (nel caso
fosse di meno procedere ad un ulteriore filtrazione come sopra).
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Eliminazione dei residui solubili in acqua
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Portare a 10 ml con acqua.
Risospendere il sedimento con una bacchetta di plastica.
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Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm.
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Eliminare il surnatante per inversione della provetta.
Portare a 10 ml con acqua.
Risospendere il sedimento con la bacchetta di plastica.
Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm.
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Eliminare il surnatante. Continuare con le stesse modalità finchè il surnatante non si presenti pulito.
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Eliminazione dei grassi e dei residui con un indice di ripartizione diverso tra l'etere a l'acqua
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Portare il sedimento a 7-7.5 ml con acqua.
Risospendere il sedimento con la bacchetta di plastica.
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Portare a 10 ml con etere etilico.
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Tappare la provetta e agitare vigorosamente con movimenti dall'alto in basso e viceversa per almeno 30 secondi.
Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm.
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A questo
punto il materiale contenuto nella provetta si sarà stratificato in
quattro frazioni; dal basso: sedimento, soluzione acquosa, residui
grossolani, grassi sciolti in etere.
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Staccare con una bacchetta il tappo di residui grossolani dalle pareti della provetta.
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Eliminare,
con un movimento deciso, le ultime tre frazioni facendo particolare
attenzione a non eliminare anche la prima (il sedimento).
Pulire le pareti della provetta con una bacchetta rivestita di cotone.
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Risospendere il sedimento con una pipetta Pasteur in vetro.
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Versare una goccia del campione su un vetrino portaoggetto e coprirla con un vetrino coprioggetto 24x24 mm.
Esaminare in modo regolare, partendo da un angolo fino ad arrivare a quello opposto con obiettivo 40x per la ricerca dei protozoi.
In caso di forma compatibili con oocisti di Cryptosporidium sp :
Colorazione Merbromina
e/o
Colorazione Ziehl-Nelseen mod.
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Lasciare, in posizione verticale il restante sedimento nella pipetta Pasteur. In tal modo, durante il tempo di osservazione del primo preparato, nella pipetta avverrà una sedimentazione dei componenti più pesanti e quindi di uova o larve eventualmente presenti.
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Versare le prime 2/3 gocce del campione su un vetrino portaoggetto e coprirle con un vetrino coprioggetto 24x32 mm.
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Esaminare in modo regolare, partendo da un angolo fino ad arrivare a quello opposto con obiettivo 10x per la ricerca di elminti.
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| | Bibliografia
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| Parasites: A guide to laboratory procedures and identification; L. R.Ash, T. C.Orihel; ASCP Press, Chicago, 1991.
| | - | Manual of Basic Techniques for a Health Laboratory; 2nd ed.; WHO, Geneva 2003.
| | - | Diagnostic Medical Parasitology; 2nd ed.; L. S.Garcia, D. A.Bruckner; American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1993.
| | - | Atlas of Wuman Protozoa-Atlante dei Protozoi Umani; E.G.Rondanelli, M.Scaglia; Masson, 1993. | | - | Parassiti e Parassitosi Umane dalla clinica al laboratorio; M.Scaglia, S.Gatti, E.G. Rondanelli; Selecta Medica, 2006. |
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