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________LABORATORIO________
Microfilaria. Osservazione microscopica diretta dopo leucoconcentrazione con metodo Brumpt.

ESAME
LEUCOCONCENTRATO

(microfilarie ematiche)
Microfilaria Wuchereria bancrofti. Osservazione microscopica diretta dopo colorazione May-Grunwald Giemsa.

L'esame leucoconcentrato (metodo secondo Brumpt) è un metodo di concentrazione che, per la sua discreta quantità di sangue (nel nostro laboratorio circa 13 ml) che è possibile processare offre una buona sensibilità nel mettere in evidenza le microfilarie.
   
Arricchimento con metodo Brumpt
 Metodo Brumpt: lisi dei globuli rossi con acqua distillata
  
   Procedimento
 
 Indossare i guanti.
    
 
 - 6 provette fondo conico.
- Sangue venoso raccolto in K2EDTA.
- Pipetta Pasteur vetro con tettina.
    
 
 Suddividere la quantità di sangue pervenuta nelle provette graduate.
    
 
 Portare a circa 8 ml di volume con acqua distillata.
    
 
 

Miscelare vigorosamente con una pipetta Pasteur in vetro per facilitare l'emolisi.

Portare la provetta a 10 ml di volume con acqua distillata.

    
 
 Centrifugare per 5 minuti a 3000 rpm.
    
 
 Eliminare il surnatante  per aspirazione con la pipetta Pasteur.
    
 
 Risospendere i sedimenti in circa 1 ml di acqua distillata e riunirli in 4 provette.
    
 
 Centrifugare per 5 minuti a 3000 rpm.
    
 
 Eliminare il surnatante  per aspirazione con la pipetta Pasteur.
    
 
 Risospendere i sedimenti in circa 1 ml di acqua distillata e riunirli in 2 provette.
Miscelare vigorosamente con la pipetta Pasteur.
Aggiungere 1 ml di acido acetico 2%.
Miscelare dolcemente con la pipetta Pasteur.
Portare le provette a 10 ml di volume con acqua distillata.
    
 
 Centrifugare per 3 minuti a 2000 rpm.
    
 
 

Eliminare il surnatante  per aspirazione con la pipetta Pasteur.
Risospendere i sedimenti in circa 1 ml di acqua distillata e riunirli in 1 provette.
Centrifugare per 3 minuti a 2000rpm.

    
 
 Eliminare il surnatante  per aspirazione con la pipetta Pasteur, lasciarne una quantità tale che sia doppia rispetto al sedimento.
   Lettura
 
 Con una pipetta Pasteur in vetro sospendere delicatamente il sedimento del leucoconcentrato.
    
 
 Trasferirne 4/5 gocce su un vetrino portaoggetto.
    
 
 Coprire con vetrino coprioggetto 24x60.
    
 
 Osservare tutto il preparato al microscopio con obbiettivo 10x.
Ripetere l’ operazione fino ad esaurimento del sedimento.
    
 
 Campione positivo: contare le microfilarie.
Nel caso il numero di microfilarie fosse molto elevato per la quantificazione procedere con il metodo "Microfilarie ematiche: esame diretto".
    
 
 Con la pipetta Pasteur depositare 1/2 gocce di sedimento su un vetrino portaoggetto.
  
 
 

Definizione del genere e della specie

Con la punta della pipetta Pasteur allargare il campione.
Non mettere il vetrino coprioggetto.

    
 
 Osservare tutto il preparato al microscopio con obbiettivo 10x.
Contate le microfilarie lasciare asciugare il campione e procedere alla colorazione.
    
 
 Il vetrino viene fissato e colorato con la stessa procedura dello striscio sottile per la ricerca della malaria "Goccia spessa e Striscio sottile".


Arricchimento con metodo Brumpt - Esame microscopico diretto
Esame Leucoconcentrato (microfilarie ematiche)
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